A espetroscopia de fluorescência induzida é utilizada para a identificação de componentes orgânicos e não-orgânicos através da excitação das suas moléculas para elevados níveis de energia, usando luz intensa. As moléculas regressam ao seu estado eletrónico fundamental, produzindo emissão fluorescente, isto é, fotões cuja energia (comprimento de onda) é determinada pela diferença nos níveis de energia molecular. Assim, o espetro de emissão pode revelar as máximas que são características para alguns tipos de substâncias. No caso da monitorização de infestação biológica, as substâncias mais importantes são a clorofila in vivo e proteínas específicas de células eucarióticas.

No enquadramento do projeto STORM foram adaptadas duas metodologias para esta aplicação: espetroscopia de fluorescência induzida por laser (LIF — laser induced fluorescence) e deteção de assinatura espetral de fluorescência (SFS — spectral fluorescence signature).

Espetroscopia LIF

Espetroscopia LIF é baseada na excitação da amostra com uma luz monocromática intensa de um laser e na deteção do espetro de emissão de fluorescência induzida através de um espetrómetro CCD (charge coupled device) de baixo ruído, oferecendo assim alta sensibilidade. O sensor LIF desenvolvido é capaz de detetar a fluorescência de clorofila in vivo sob a excitação com luz de 532 nm (verde visível) produzida por um laser Nd:YAG pulsado de estado sólido de dupla frequência (Fig. 1).

Fig. 1. Espetros LIF típicos obtidos através de excitação de uma superfície de gesso limpa (vermelho) e de uma área afetada por uma infestação biológica (azul). O último espetro expressa dois picos de assinatura de clorofila, nos comprimentos de onda de 650 e 750 nm.

Deteção SFS

A deteção SFS é baseada na fluorescência induzida por uma lâmpada de largo espetro de luz. O largo espetro permite fazer uma varredura do comprimento de onda de excitação, utilizando um monocromador controlado por computador. Isto introduz um novo parâmetro variável às condições de medição, que transforma gráficos de espetros de fluorescência, como os da Fig. 1, em superfícies cuja densidade espetral da emissão de fluorescência detetada é uma função dos comprimentos de onda da excitação e da emissão. Devido a uma menor intensidade da excitação da radiação, a sensibilidade desta metodologia é normalmente menor do que a da espetroscopia LIF. No entanto:

a perda de excitação produzida é parcialmente compensada por um detetor mais sensível com amplificação interna – um fotomultiplicador (PMT),
em algumas áreas dos espetros 2D de fluorescência, a sensibilidade da deteção SFS pode ser igual ou mesmo maior que a da LIF, devido à eficiência quântica “ressonante” do processo de fluorescência para um específico par de comprimentos de onda de excitação e emissão.

Por esta razão, o espetrómetro SFS é capaz de detetar não somente a emissão de clorofila (na gama VIS/RI), mas também as assinaturas espetrais de fluorescência de proteínas específicas (na gama UV), que compõem bactérias e fungos, como ilustrado na Fig. 2.

                  Gama VIS/IR: assinatura de clorofila                                            Gama UV range: assinatura de proteína

Fig. 2. Exemplos de deteção SFS típica nas áreas VIS e UV que contêm as assinaturas de clorofila e de proteína, respetivamente. As escalas de cor representam a intensidade de emissão de fluorescência expressa em unidades arbitrárias.

Testes iniciais e demonstração pública

No final de julho de 2017, o sensor LIF for adaptado para as medições da infestação biológica na antiga Basílica Cristã de Tróia, sendo capaz de operar com um fluxo de radiação reduzida de cerca de 5 mJ/cm2 por pulso de laser, de forma a não prejudicar o estado fotossintético da vegetação em investigação. O sensor SFS foi também desenvolvido e operacionalizado. Foram executadas duas campanhas experimentais de diagnóstico em Tróia, nos dias de 3 de agosto e 22 de setembro de 2017.

Fig. 3. Medições SFS, frescos da Basílica Cristã em Tróia.

A metodologia de deteção SFS foi demonstrada aos parceiros e stakeholders do projeto STORM no dia de 1 de novembro, durante uma visita a Tróia, no âmbito da reunião plenária do projeto em Lisboa.

Fig. 4. Demonstração da tecnologia de medição SFS.